金黃色葡萄球jun殺滅率測(cè)試技術(shù)指南：從方法驗(yàn)證到效果評(píng)價(jià)

一、標(biāo)準(zhǔn)與法規(guī)依據(jù)

1. 國(guó)內(nèi)核心標(biāo)準(zhǔn)

GB/T 27947-2020《消毒劑殺滅微生物效果評(píng)價(jià)方法》：規(guī)定懸液定量法、載體定量法等測(cè)試流程，金黃色葡萄球jun殺滅率≥99.9%為消毒合格。

GB 15981-2012《消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)》：明確醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用的消毒劑需達(dá)到殺滅率≥99.999%的滅菌要求。

GB 27951-2011《皮膚消毒劑衛(wèi)生要求》：適用于手消毒劑、皮膚黏膜消毒劑的金黃色葡萄球jun殺滅效果評(píng)價(jià)。

2. 國(guó)際方法對(duì)比

AOAC 966.04：采用懸液法測(cè)試化學(xué)消毒劑對(duì)金黃色葡萄球jun的殺滅活性，作用時(shí)間通常為30秒至10分鐘。

EN 13704：歐洲標(biāo)準(zhǔn)，要求載體法測(cè)試中殺滅率達(dá)到99.999%，且需通過中和劑驗(yàn)證和有機(jī)物干擾試驗(yàn)。

二、測(cè)試原理與菌株準(zhǔn)備

1. 菌株特性與培養(yǎng)

標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球junATCC 6538（凝固酶陽性，具有β-溶血活性），購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

復(fù)蘇與培養(yǎng)：

1.從凍干管取少量菌粉接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24小時(shí)；

2.挑取單個(gè)菌落接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃振蕩培養(yǎng)18小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600=0.5，活菌濃度約10?CFU/mL）。

2. 菌懸液制備

稀釋步驟：取1mL菌液加入9mL 0.03mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2），梯度稀釋至10?-10?CFU/mL，備用。

濃度驗(yàn)證：取0.1mL稀釋菌液涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，確保濃度符合試驗(yàn)要求。

三、關(guān)鍵測(cè)試方法與步驟

1. 懸液定量殺菌試驗(yàn)

（1）中和劑篩選（關(guān)鍵前驗(yàn)證）

目的：消除消毒劑殘留對(duì)活菌計(jì)數(shù)的干擾，確保結(jié)果準(zhǔn)確。

方法：采用稀釋法測(cè)試3種中和劑濃度（0.1%、0.5%、1%硫代liu酸鈉），選擇能wan全中和且對(duì)菌株無毒性的配方。

判定標(biāo)準(zhǔn)：中和劑對(duì)照組菌落數(shù)與陰性對(duì)照組差異≤10%，且中和產(chǎn)物無抑菌作用。

（2）殺菌處理與活菌計(jì)數(shù)

操作流程：

1.試驗(yàn)組：取0.5mL菌懸液+4.5mL消毒劑（如含氯消毒劑500mg/L），20℃水浴作用指定時(shí)間（1min、5min、10min）；

2.中和終止：立即取0.5mL混合液加入4.5mL中和劑，混勻后靜置10分鐘；

3.活菌計(jì)數(shù)：取0.1mL中和后液體涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)菌落（結(jié)果以CFU/mL表示）。

對(duì)照組設(shè)置：

陽性對(duì)照：菌懸液+PBS（無消毒劑）

陰性對(duì)照：消毒劑+中和劑（無菌懸液）

2. 載體定量殺菌試驗(yàn)（模擬實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景）

載體選擇：不銹鋼片（1cm×1cm，經(jīng)脫脂滅菌）或玻璃片，適用于表面消毒產(chǎn)品測(cè)試。

試驗(yàn)步驟：

1.載體接種：取10μL菌懸液滴加于載體表面，37℃干燥30分鐘（形成菌膜）；

2.消毒處理：將載體wan全浸泡于消毒劑中，設(shè)定作用時(shí)間后取出，轉(zhuǎn)移至中和劑中超聲洗脫（功率300W，時(shí)間1分鐘）；

3.結(jié)果計(jì)算：洗脫液傾注平板培養(yǎng)，按公式計(jì)算殺滅率：

4.殺滅率（%）=（對(duì)照組平均活菌數(shù)-試驗(yàn)組平均活菌數(shù)）/對(duì)照組平均活菌數(shù)×100%

四、結(jié)果判定與影響因素

1. 合格標(biāo)準(zhǔn)

消毒產(chǎn)品：作用時(shí)間內(nèi)殺滅率≥99.9%（如手消毒劑作用30秒）；

滅菌產(chǎn)品：殺滅率≥99.999%（如手術(shù)器械消毒劑作用15分鐘）；

特殊場(chǎng)景：醫(yī)療機(jī)構(gòu)高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域使用的消毒劑需達(dá)到≥99.9999%殺滅率。

2. 關(guān)鍵影響因素

溫度：試驗(yàn)溫度控制在20±1℃，溫度升高可加速殺菌（如37℃下殺滅率比20℃提高2倍）；

pH值：含氯消毒劑在pH 6-7時(shí)殺菌效果為佳，堿性條件下穩(wěn)定性增強(qiáng)但殺菌活性下降；

有機(jī)物干擾：加入1%-5%小牛血清模擬體液污染，可使殺滅率降低1-2個(gè)數(shù)量級(jí)，需在報(bào)告中注明。

五、典型案例分析

案例1：含氯潔廁劑殺菌效果驗(yàn)證

測(cè)試條件：消毒劑濃度500mg/L，作用時(shí)間5分鐘，懸液法測(cè)試。

結(jié)果：

對(duì)照組活菌數(shù)：3.2×10?CFU/mL

試驗(yàn)組活菌數(shù)：28 CFU/mL

殺滅率=（3.2×10?-28）/3.2×10?×100%=99.99%（符合GB 27951要求）

案例2：中和劑選擇不當(dāng)導(dǎo)致結(jié)果偏差

問題：使用0.1%硫代liu酸鈉中和過氧乙酸消毒劑，中和不wan全。

現(xiàn)象：試驗(yàn)組活菌數(shù)為0 CFU/mL，殺滅率100%，但中和劑對(duì)照組菌落數(shù)顯著低于陽性對(duì)照（差異＞30%）。

改進(jìn)：更換為0.5%硫代liu酸鈉+0.5%吐溫80復(fù)合中和劑，結(jié)果恢復(fù)正常。

六、質(zhì)量控制與注意事項(xiàng)

1. 試驗(yàn)全程質(zhì)控措施

菌株質(zhì)控：每批次試驗(yàn)前驗(yàn)證菌株純度（革蘭氏染色鏡檢）和活性（生長(zhǎng)曲線測(cè)定）；

平板計(jì)數(shù)質(zhì)控：同一稀釋度做2個(gè)平行平板，菌落數(shù)差異≤15%，取平均值計(jì)算；

環(huán)境控制：生物安全柜內(nèi)操作，避免交叉污染，試驗(yàn)溫度波動(dòng)≤±1℃。

2. 常見問題解決方案

菌落蔓延：可在培養(yǎng)基中加入0.1%TTC（氯化三苯四氮唑），使菌落顯色便于計(jì)數(shù)；

消毒劑穩(wěn)定性：含氯消毒劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，作用過程中監(jiān)測(cè)有效氯濃度（如使用DPD比色法）。

七、中科檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1.全方法覆蓋：具備懸液法、載體法、現(xiàn)場(chǎng)模擬試驗(yàn)等完整測(cè)試能力，CNAS認(rèn)可參數(shù)覆蓋國(guó)內(nèi)外主流標(biāo)準(zhǔn)。

2.快速檢測(cè)服務(wù)：提供24小時(shí)加急服務(wù)，3天出具初步結(jié)果，滿足企業(yè)產(chǎn)品上市前驗(yàn)證需求。

3.定制化方案：針對(duì)特殊產(chǎn)品（如濕巾、凝膠消毒劑）開發(fā)專屬測(cè)試流程，解決復(fù)雜基質(zhì)干擾問題。

注：常規(guī)測(cè)試周期為5-7個(gè)工作日，報(bào)告包含中和劑驗(yàn)證數(shù)據(jù)、殺滅率計(jì)算過程及結(jié)果判定，可直接用于消毒產(chǎn)品備案和市場(chǎng)監(jiān)管部門抽檢。